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叶绿素的荧光光谱测量

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实验背景:「叶绿素」的光学知识

       叶绿素是植物从光中吸收能量所需的基本色素。它在可见光谱的蓝色和红色部分吸收光较强,在可见光谱的绿色部分吸收光较弱,这使它在人的肉眼中成为可识别的绿色。

       叶绿素的检测可以追溯到19世纪早期,1817年Joseph Caventou和Pierre Pelletier将其分离出来。后来,利用了立体化学、核磁共振、光学和质谱等方法检测了分子的元素组成和一般结构。

要确定叶绿素浓度,其中一种方法就是测量其荧光发射率。叶绿素在650-800 nm范围内可以检测到荧光,再通过测量700 nm和735 nm左右波长的荧光发射峰值,计算它们的比值,可以推导出叶绿素含量的线性关系。

叶绿素的存在是植物呈现绿色的原因,而缺乏叶绿素会导致叶子的颜色变成红色或黄色。基于这一点,我们使荧光发射峰值更高,从而得到叶绿素浓度更高的绿色一品红叶。

本实验将过比较不同颜色一品红(红、绿、白)叶片的荧光光谱,测定其叶绿素浓度。

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图1 用于实验的一品红植物

溶解在甲醇中的红色叶片样本(左),绿色叶片样本(中)和白色叶片样本(右) 

此外,我们还将测量一个白色一品红片样本,对比其与红色和绿色叶子样本的叶绿素浓度。测量时,每一片叶子都被溶解在甲醇中,以便从每个样品中分离并提取叶绿素(图1)。

实验系统:

本实验的系统如图所示(图2)。光谱仪使用的是AvaSpec-ULS2048CL-EVO,该设备拥有新的光谱学技术。这款光谱仪提供USB3.0通信,速度是USB2.0的10倍,使用了CMOS探测器,AS-7010电路板,这款电路板上可以存储更多的光谱,实现更多功能。此外,这款光谱仪可以定制狭缝尺寸,光栅,光纤入口和连接器,以满足各类应用需求。

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图2:叶绿素测量实验装置

其他用于实验的配件有单色仪, 用于过滤特定波长光源,以确保只有所需观察的发射光谱。比色皿支架(CUV-DA),可以使样品暴露在较大的光量下。一个比色皿遮罩 (CUV-COVER-DA),用来减少环境光的影响。600微米纤芯光纤(FC-UVIR600-1-BX),用来连接光谱仪和比色皿。三个样品(红叶样品、绿叶样品和白叶样品)都放入比色皿中测量。

实验方法及数据:

每个叶片样本溶解在约30ml的甲醇中,将存有样本的溶液在120°C的加热板上加热1分钟来提取叶绿素,再将混合溶液移入比色皿中进行分析测量。将单色仪直连到AvaLight-Hal-S-Mini上,接着在不同波长之间循环测试,直到找到能使样品达到亮度较大的波长,此激发波长为620 nm处。

数据分析模块,我们使用了AvaSoft的Sd模式,AvaSoft是我们定制的软件包。Sd模式是测量荧光的常用模式。因为Sd模式从每个波长的原始计数(即范围模式)中减去暗背景光谱(光谱仪在没有光源的情况下测量的光谱)。这有助于减少光谱中的噪声,并更好地隔离发射峰。

调整积分时间可以增加或减少一次测量的光量,这会影响结果光谱的整体幅度大小。平均次数表明两个值被平均在一起,可以提供更一致的光谱结果。实验时,我们将积分时间设为9秒,平均值设为2。此外,我们用试管支架盖覆盖了所有样品,以确保测量的光来自光源,避免环境光的影响。

实验结果分析:

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图3:红色一品红样品的荧光光谱

发射峰在673.90 nm和722.84 nm

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图4:绿色一品红样品的荧光光谱

发射峰在687.17 nm和730.87 nm

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图5:白色一品红样品的荧光光谱

发射峰在675.63 nm和726.28 nm

红色一品红叶片样品的荧光光谱测量到的发射峰在673.90 nm和722.84 nm(图3)。这符合与文献报道中所描述的的:叶绿素发射峰在650-800 nm之间。

绿色一品红叶片样品的荧光光谱在687.17 nm和730.87 nm处显示更高的发射峰(图4)。与红色叶片样品相比,这两个峰略高,但仍与文献报道所描述的叶绿素发射峰一致。

白色一品红叶片样品的荧光光谱(图5)与红色叶片样品具有相似的发射峰(675.63 nm和726.28 nm),但每个发射峰的强度更大。

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图6:三种样品的荧光光谱对比图


红色一品红样品(红色线),绿色一品红样品(绿色线),白色一品红样品(蓝色线)

图6为红色一品红样品(红色线)、绿色一品红样品(绿色线)和白色一品红样品(蓝色线)的荧光光谱比较。为了直接比较每个样品的叶绿素含量,计算735 nm和700nm峰值的比。红叶样本,两个峰的比值为7492.67/26998.33,等于0.278。对于绿叶样本,比值为44973.55/53473.00,即0.841。白叶样本的比值为13650.20/44659.54,即0.306。

综上所述,红叶和白叶样品相比,绿叶样品中的叶绿素浓度要高得多。此外,红叶和白叶样本的叶绿素浓度相似,尽管白叶样本比红叶样本看起来更绿。




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